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申请/专利权人：中国水产科学研究院东海水产研究所

摘要：本发明涉及一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，包括：提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；利用上游引物和下游引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’‑GATTATTATGCTGGGATTAG‑3’，下游引物为5’‑ACCCTCTTTCGCTTCA‑3’；将目的片段的PCR产物直接进行凝胶电泳，根据PCR产物条带的大小判断物种类别。采用本发明能够经济、快速、简便的进行近江和熊本牡蛎的鉴定，测序验证的结果显示鉴别的准确率为100％；这种鉴定方法将在水产养殖、资源调查、环境保护中发挥重要作用。

主权项：1.一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，包括：1提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；2利用上游引物和下游引物对步骤1中的基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’‑GATTATTATGCTGGGATTAG‑3’，下游引物为5’‑ACCCTCTTTCGCTTCA‑3’；3将步骤2中的目的片段的PCR产物直接进行凝胶电泳，根据PCR产物条带的大小判断物种类别；其中，PCR条形带中近江牡蛎的目的片段为599±2bp，熊本牡蛎目的片段为531±2bp，两者相差约68±4bp。

全文数据：一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法技术领域本发明属于水产物种鉴定领域，特别涉及一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法。背景技术牡蛎礁是由大量牡蛎聚集生长于硬底物表面所形成的一种生物礁系统，它广泛分布于温带河口和滨海区。牡蛎礁恢复是养护近岸渔业资源、修复近岸渔业水域生态系统的重要手段之一。近江牡蛎Crassostreaariakensis和熊本牡蛎Crassostreasikamea共存分布于长江口、杭州湾及江苏沿岸，是我国东海区的主要造礁牡蛎物种。但针对特殊的区域选择哪种牡蛎开展牡蛎礁恢复工程可以达到更好的生态恢复效果尚属未知。而两者的物种鉴别，是开展生态修复的前提。另外，牡蛎是国内外主要的经济贝类之一，营养价值和经济价值颇高。牡蛎养殖是贝类养殖业中的支柱产业。由于牡蛎贝壳的形态可塑性强，易受环境影响，因此，仅凭外部形态有时很难区分具体种类，尤其牡蛎幼体和稚贝更是如此。这既是贝类分类学上的一个难题，也对牡蛎养殖、野外资源保护和可持续开发利用、以及生态修复工作不利。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，该方法是一种操作简便、成本低、耗时短、准确率高的近江牡蛎和熊本牡蛎的分子鉴别方法。本发明的一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，包括：1提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；2利用上游引物和下游引物对步骤1中的基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’-GATTATTATGCTGGGATTAG-3’，下游引物为5’-ACCCTCTTTCGCTTCA-3’；3将步骤2中的目的片段的PCR产物直接进行凝胶电泳，根据PCR产物条带的大小判断物种类别。所述步骤1中基因组DNA为近江牡蛎和熊本牡蛎的肌肉组织中总基因组DNA；提取方法为酚-氯仿法。所述酚-氯法为经典的酚-氯法，具体操作步骤如下：1消化前的处理。用滤纸吸干样品中的液体，取适量背部组织加至相应的离心管中，加入1000μL的终浓度1molL的Tris-ClpH＝8.0于离心管中，用灭菌的手术剪充分剪碎，室温放置1h。4℃，12000rpmmin，离心10min。去上清液。2消化。分别向离心管中，加600μL的Trisbuffer，50μL的10％的SDS，10μL的蛋白酶K，于振荡仪上振荡混匀。置于56℃水浴锅中，水浴过程中多次人工混匀，直至消化至澄清。3DNA的抽提及纯化。加饱和苯酚Phenolsaturated350μL，350μL氯仿异戊醇25:24:1，颠倒摇匀10min。4℃，12000rpmmin，离心10min。取上清液。重复上述步骤，进行第二次抽提。取上清液。加等体积的氯仿异戊醇，混匀10min。4℃，12000rpmmin，离心10min。取上清液。4DNA的沉淀及干燥。向步骤3获取的上清液中，加2倍体积的冰无水乙醇，混匀后于-20℃条件下静置2h。4℃，10000rpmmin，离心15min。快速去除上清液，将离心管倾斜放于超净工作台内自然晾干。沉淀用70％乙醇洗涤三次5DNA溶解。向步骤4获得的DNA中，加100μL的无菌双蒸水，先放至4℃条件下，使DNA充分溶解。移至-20℃条件下保存备用。6DNA检测。取8μL步骤5中的DNA，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测DNA的提取情况。其余DNA仍放在-20℃条件下保存备用。所述步骤2中PCR反应体系包括以下成分：100ngDNA模板，dNTPs终浓度0.2mmolL，引物终浓度各0.4umolL，MgCl2终浓度2.0mmolL，12.5uL2×reactionbuffer，1.25UTaq聚合酶，然后加去离子水至终体积25μL；PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；接下来为37个循环，每个循环包括94℃变性45s，51℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸8min。所述步骤3中PCR条形带中近江牡蛎的目的片段为599±2bp，熊本牡蛎目的片段为531±2bp，两者相差约68±4bp。所述步骤3中凝胶电泳为1.4％的琼脂糖凝胶电泳。采用本发明能够经济、快速、简便的进行近江和熊本牡蛎的鉴定，测序验证的结果显示鉴别的准确率为100％；这种鉴定方法将在水产养殖、资源调查、环境保护中发挥重要作用。本发明中涉及的分子生物学鉴定标记，为解决熊本牡蛎和近江牡蛎物种鉴别的难题，提供了一个非常好的科学方法。本发明为国内外首创，不仅对牡蛎的分类学具有重要学术意义，而且也为牡蛎养殖、资源保护和可持续开发利用、生态修复等提供基础技术支撑，具有重要的实际应用价值。有益效果1本发明的方法经济、快速、简便，准确率高，在水产养殖、资源调查、环境保护中发挥重要作用；2本发明为解决熊本牡蛎和近江牡蛎物种鉴别的难题，提供了一个非常好的科学方法，不仅对牡蛎的分类学具有重要学术意义，而且也为牡蛎养殖、资源保护和可持续开发利用、生态修复等提供基础技术支撑，具有重要的实际应用价值。附图说明图1为实施例1中通过PrimerPremier5设计引物得到上游引物；图2为实施例1中通过PrimerPremier5设计引物得到下游引物；图3为实施例1中PCR产物电泳结果图；图4为实施例1中PCR产物测序结果比对后的部分差异情况。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11、实验材料收集和DNA提取通过形态学鉴定，采集熊本牡蛎和近江牡蛎样本肌肉组织。采用经典的酚-氯仿法抽提两种牡蛎肌肉组织中总基因组DNA，-20℃保存备用。其中，酚-氯仿法抽提总基因组DNA的方法：1消化前的处理。用滤纸吸干样品中的液体，取背部组织加至相应的离心管中，加入1000μL的终浓度1molL的Tris-ClpH＝8.0于离心管中，用灭菌的手术剪充分剪碎，室温放置1h。4℃，12000rpmmin，离心10min。去上清液。2消化。分别向离心管中，加600μL的Trisbuffer，50μL的10％的SDS，10μL的蛋白酶K，于振荡仪上振荡混匀。置于56℃水浴锅中，水浴过程中多次人工混匀，直至消化至澄清。3DNA的抽提及纯化。加饱和苯酚Phenolsaturated350μL，350μL氯仿异戊醇25:24:1，颠倒摇匀10min。4℃，12000rpmmin，离心10min。取上清液。重复上述步骤，进行第二次抽提。取上清液。加等体积的氯仿异戊醇，混匀10min。4℃，12000rpmmin，离心10min。取上清液。4DNA的沉淀及干燥。向步骤3获取的上清液中，加2倍体积的冰无水乙醇，混匀后于-20℃条件下静置2h。4℃，10000rpmmin，离心15min。快速去除上清液，将离心管倾斜放于超净工作台内自然晾干。沉淀用70％乙醇洗涤三次5DNA溶解。向步骤4获得的DNA中，加100μL的无菌双蒸水，先放至4℃条件下，使DNA充分溶解。移至-20℃条件下保存备用。6DNA检测。取8μL步骤5中的DNA，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测DNA的提取情况。其余DNA仍放在-20℃条件下保存备用。2、PCR引物设计从NCBI网站上http:www.ncbi.nlm.nih.gov下载近江牡蛎和熊本牡蛎的线粒体基因组全序列；经调整、Clustal软件比对，根据两者的序列差异，用PrimerPremier5设计引物上下游引物序列分别见图1和图2。结果显示上游引物为5’-GATTATTATGCTGGGATTAG-3’，下游引物为5’-ACCCTCTTTCGCTTCA-3’。3、PCR反应用上述的上下游引物扩增线粒体DNA的目的片段。PCR反应体系包括以下成分：100ngDNA模板，dNTPs终浓度0.2mmolL，引物终浓度各0.4umolL，MgCl2终浓度2.0mmolL，12.5uL2×reactionbuffer，1.25UTaq聚合酶，然后加去离子水至终体积25μL。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；接下来为37个循环，每个循环包括94℃变性45s，51℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸8min。4、PCR产物电泳将PCR产物直接放入1.4％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳条件为：电压130V，时间100min，缓冲液为TBE。结果显示熊本牡蛎目的片段长度为531±2bp；近江牡蛎目的片段长度599±2bp，两者相差约68±4bp见图3，从左至右各泳道PCR产物依次为：1-4熊本牡蛎；5-6熊本牡蛎和近江牡蛎混合样品；7-10近江牡蛎；11泳道分子量标记AL2000Marker。根据电泳结果可明确的鉴别出近江牡蛎和熊本牡蛎。5、对PCR产物的测序验证利用Sanger的双脱氧链终止法对PCR产物进行测序，然后用Clustal软件比对，结果显示近江牡蛎和熊本牡蛎约68±4bp的片段差异，是由序列的插入缺失引起部分缺失片段见图4，从上至下各序列依次为：AA5-AD5为近江牡蛎；SE5-SG5为熊本牡蛎。

权利要求：1.一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，包括：1提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；2利用上游引物和下游引物对步骤1中的基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’-GATTATTATGCTGGGATTAG-3’，下游引物为5’-ACCCTCTTTCGCTTCA-3’；3将步骤2中的目的片段的PCR产物直接进行凝胶电泳，根据PCR产物条带的大小判断物种类别；其中，PCR条形带中近江牡蛎的目的片段为599±2bp，熊本牡蛎目的片段为531±2bp，两者相差约68±4bp。2.根据权利要求1所述的一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，其特征在于，所述步骤1中基因组DNA为近江牡蛎和熊本牡蛎的肌肉组织中总基因组DNA；提取方法为酚-氯仿法。3.根据权利要求1所述的一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR反应体系包括以下成分：100ngDNA模板，dNTPs终浓度0.2mmolL，引物终浓度各0.4μmolL，MgCl2终浓度2.0mmolL，12.5μL2×reactionbuffer，1.25UTaq聚合酶，然后加去离子水至终体积25μL。4.根据权利要求1所述的一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；接下来为37个循环，每个循环包括94℃变性45s，51℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸8min。5.根据权利要求1所述的一种分子鉴别近江牡蛎和熊本牡蛎的方法，其特征在于，所述步骤3中凝胶电泳为1.4％的琼脂糖凝胶电泳。

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