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申请/专利权人：新疆生化药业有限公司

摘要：本发明涉及一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，该方法经过石油醚脱脂，超声波辅助提取凝乳酶，脱盐，冷冻浓缩，饱和硫酸铵梯度沉淀，离心，透析袋脱盐，冷冻干燥，得到羔羊皱胃总凝乳酶；再经阴离子交换色谱柱用氯化钠溶液梯度洗脱获得两种离子强度的凝乳酶，经透析袋脱盐，冷冻干燥得精制凝乳酶。再将两种离子强度的凝乳酶部位B1和B2分别用HPLC凝胶柱分离，得到了B1‑P1,B2‑P1,P2等凝乳酶活性成分，其中B2‑P2电泳条带含杂质条带，因此只取B1‑P1和B2‑P1作为凝乳酶标准品。通过本发明所述方法获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品，凝乳酶活性高，纯度高，电泳条带清晰；方法成熟，操作简单不繁琐，易于放大大量制备；获得的羔羊皱胃凝乳酶标准品可以用于医药和食品领域。

主权项：1.一种羔羊皱胃凝乳酶标准品的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：提取凝乳酶：a、将已活化的羔羊皱胃原料药粉末在温度4-10℃下，磁力搅拌，石油醚脱脂2次，即得羔羊皱胃脱脂粉，于温度-20℃保存；b、将步骤a得到的脱脂粉末用预冷的0.5%-5%氯化钠溶液以料液比1:18-1:25gml，在温度4-10℃，超声功率400瓦下，超声30分钟，提取2次，在温度4℃，8000转分钟下离心10分钟，取上清液；c、将步骤b中得到的上清液冷冻浓缩至15体积，用透析袋脱盐，开始2小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析4次，得到脱盐后的凝乳酶提取液，再将凝乳酶提取液冷冻干燥即为羔羊皱胃凝乳酶提取物，低温保存；总凝乳酶制备：d、将步骤c得到的脱盐后凝乳酶提取液冷冻浓缩至提取液的14-16体积，用0.5mol的氢氧化钠调节pH至4.6，测量体积，转移至锥形瓶，备用；e、将步骤d得到的溶液体积，称取30%饱和度的硫酸铵搅拌溶解，在温度4-10℃下静止12小时后，在温度4℃，5000转min条件下离心10分钟，取上清液，用50%饱和硫酸铵继续沉淀后，5000转min条件下离心10分钟，将上清液用90%饱和硫酸铵沉淀4h后，离心弃去上清液，得到沉淀物；f、将步骤e得到的90%饱和硫酸铵沉淀物用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析2次后每4个小时换1次水，透析7次后，冷冻干燥得到羔羊皱胃总凝乳酶粉末，得到总凝乳酶；凝乳酶部位：g、将步骤f得到的总凝乳酶用0.05摩尔pH5.8的磷酸盐缓冲液溶解配置浓度为15mgml的样品溶液；用0.05摩尔pH5.8的磷酸盐缓冲液平衡DEAE阴离子交换树脂，将样品溶液以0.6mlmin的流速依次用0.05摩尔pH5.8的磷酸盐缓冲液，0.1-0.5摩尔的氯化钠溶液梯度洗脱；h、分别收集0.3，0.4摩尔氯化钠洗脱部位，用透析袋脱盐，每2个小时换1次水，透析4次后，每4个小时换1次水，透析7次后冷冻干燥，得到代号分别为B1,B2的凝乳酶部位，羔羊皱胃凝乳酶标准品：i、将步骤g中获得的凝乳酶部位B1,B2，分别用氯化钠溶液溶解，配置成10mgml的B1,B2的样品溶液，再用TSKgel高效液相凝胶色谱柱分离纯化，色谱条件为，Shimaduz高效液相色谱仪，色谱柱：TSKgelG300PWxL7.8×30mm，7μm，流动相：氯化钠溶液，上样量：30µL，洗脱液流速：0.4mlmin，再用透析袋脱盐，开始2个小时换1次水，透析2次后，每4个小时换1次水，透析4次，即获得羔羊皱胃凝乳酶标准品。

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