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申请/专利权人：上海海洋大学

摘要：本发明公开了高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用，在基因簇中确定基因删除的靶点序列，设计特异性CRISPRgRNA靶点序列和扩增引物，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，纯化，体外转录，gRNA与Cas9蛋白显微注射并提取基因组进行PCR扩增，依次经过T7E1酶切和琼脂糖凝胶电泳得到的胶图检测条带灰度值，得到每个条带的亮度体积计算敲除效率，组成最优靶点组合进行显微注射并提取基因组，经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，稳定培养即得。本发明首次采用CRISPR单位点敲除效率评估，筛选CRISPR靶点组合产生高效的基因组大片段删除，可用于脊椎动物的基因组中基因大片段的高效删除。

主权项：1.高效构建基因组大片段删除突变体的方法，其特征在于，所述高效构建基因组大片段删除突变体的方法在斑马鱼ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中进行基因组大片段删除，所述方法首先筛选出拥有高突变效率的gRNA，随后选择效率差值较小的gRNA进行组合显微注射至一细胞期的斑马鱼受精卵中，采用CRISPR单位点效率评估筛选出CRISPR组合产生高效的基因组大片段删除，包括以下步骤：1在斑马鱼的ttn1-ttn2、nppa-nppb和hox基因簇中确定基因敲除的靶点序列，在符合CRISPRPAM区的条件下其待删除基因片段两端分别设计不少于三个特异性CRISPRgRNA靶点序列；2根据步骤1设计的特异性CRISPRgRNA靶点序列分别设计扩增引物；3以gRNA骨架质粒为模板，采用引物T7-gRNAtarget作为正向引物和gRNA反向引物进行PCR扩增，得到PCR产物；4步骤3得到的PCR产物进行纯化，体外转录，获得gRNA；5步骤4得到的gRNA与Cas9蛋白或Cas9mRNA显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中；6挑选步骤5中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组，用敲除靶点检测引物进行PCR扩增，得到PCR产物；7步骤6得到的PCR产物依次进行T7E1酶切检测和琼脂糖凝胶电泳，得到的胶图根据ImageLab软件定量工具检测条带灰度值，得到a、b和c每个条带的亮度体积，根据公式indel％＝a+ba+b+c×100％计算得到敲除效率；8从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点中选取不少于三组特异性CRISPR靶点组成最优靶点组合；9步骤8中得到的最优靶点组合分别显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中；10挑选步骤9中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组，依次经过双外侧引物PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，稳定培养得到得斑马鱼基因组大片段删除突变体；步骤8中，从待删除基因片段两端的特异性CRISPR靶点中选择T7E1酶切活性高且相似的特异性CRISPR靶点作为最优靶点组合；步骤1中，所述靶点序列如下表所示：

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